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PCR産物とpGEM-T-easy Vectorを用いてTAクローニングを行いました。アンピシリンとXgal,IPTGを加えて青白選択を行ったのですが、Vectorの lacZ遺伝子配列内のMCSにインサートが入り、ラクトースオペロンが機能できなくなれば白色コロニーができますよね?青色コロニーの場合は、ラクトースオペロンが働いて生成されたβガラクトシダーゼによりXgalが分解されますが、図のような不完全な環状のVectorがどのようにして機能するのですか。セルフライゲーションが起こっているのですか。
実際に青色コロニーが生えていたので、Vectorのおかげでアンピシリン耐性を持っているということですよね?

Xmnl 2009 T7! 1 start 14 20 26 31 37 43 43 49 52 Scal 1890 Nael 2707 Apal Aatll Sphi BstZI f1 ori Ncol BstZI Notl Sacll ECORI Amp PGEM-T Easy Vector lacZ (3015bp) Spel ECORI |Notl BstZI Pstl Sall |Ndel Sacl BstXI |Nsil f 64 70 77 77 88 90 97 109 118 127 141 ori SP6 1473VAD5_6A

回答

✨ ベストアンサー ✨

lacZ遺伝子がコードしているのはβ-ガラクトシダーゼです。そして、Xgalは無色〜黄色ですが、β-ガラクトシダーゼによって加水分解されると青くなります。

pGEM-T-easy vectorの場合、MCSにインサートが入るとβ-ガラクトシダーゼが前後に分断されて機能しなくなるので、基質のXgalがあっても青くなりません。ですので、インサートが入ったvectorを持つE.coliは、アンピシリン耐性を持っていて白いコロニーが生えます。

インサートが入らずにセルフラーゲーションした場合は、β-ガラクトシダーゼが分断されずに機能しますので、Xgalを青くします。ですので、インサートが入らなかった(セルフラーゲーションをした)vectorを持つE.coliは、アンピシリン耐性を持っていて青いコロニーが生えます。

ラクトースオペロンの場所は、こちらの省略化されたマップには記載されていません。
Promegaの説明書には原理や使い方が書かれていますので、お読みになることをお勧めします。

エミリ

ありがとうございます。

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