クローニングでDNA導入を用いる場合の方法って○○方法って名前があるんですか

生物

高校生

約4年前

なず

クローニングでDNA導入を用いる場合の方法って○○方法って名前があるんですか？調べても出てきません。。
PCR法とは別です。お願いします🙇‍♂️

クローニング pcr法バイオテクノロジー

回答

Joker

約4年前

④大腸菌に導入する。
このプロセスが、遺伝子を導入している部分になります。
これを、どのようにやるのか、ということでいくつか名前がつけられています。
おそらく高校で扱うものであれば、ヒートショック法か、リン酸カルシウム法のいずれかだと思われます。

調製したプラスミドを含む溶液を、大腸菌に少しずつ滴滴とふりかけていったのであれば、リン酸カルシウム法。
プラスミドと大腸菌などが含まれる溶液を、40度あたりでしばらく温めたのであれば、ヒートショック法。

になるかと。

ご参考までに。

なず約4年前

皆さま本当にありがとうございます。
色々な回答を見て色々な視点から考えてなんとか理解することが出来たと思います！！（笑）
全ての回答丁寧でわかり易すぎてベストアンサー選べません…
難しい分野なのにこんなに親切に答えてくれる方々が居てくださって助かりました、ありがとうございました🙇‍♂️

Joker 約4年前

BAは基にしなくても良いですよ。
個人的に、その後調べてみましたが、
自分で実験しているときには、みなさんおっしゃる通り特に名前などはそこまで意識してなかったのですが、
つい気になって調べてみました。

高校の資料集などでは、遺伝子導入の方法として、
１．マイクロインジェクション法
２．エレクトロポレーション法
３．リポフェクション法
４．ウイルスや細菌の利用
５．パーティクルガン法
６．ヒートショック法
などがのっていました。

大腸菌への遺伝子導入ですので、
リン酸カルシウム法は使わないですね。失礼しました。
高校段階での大腸菌への遺伝子導入として一般的なものは、
基本的にヒートショック法のようでした。
ご参考までに。

なず約4年前

そうなんですね！本当にありがとうございます。
とても参考になります！！🙇‍♂️

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安田ヒデ

約4年前

ゲノムプロジェクトで用いられた方法についてのことでしたらショットガンクローニング法だと思います。
この方法は最初にヒトゲノムプロジエクトでゲノムのDNA配列を求めるために使われた方法で、ごく簡単にいうと、ゲノムDNAを超音波や制限酵素で断片化しそれをクローニングベクターに断片を選ばずにつないだのち、大腸菌に導入して各種のDNA断片をクローニングする方法です。そのあと、それら断片のDNA配列を求めるわけです。あとはたくさん得られたDNAの配列をbioimformatics（バイオインフォーマテクス）（コンピュータでの解析）で繋げていってDNA配列を求める方法です。
この方法のこと以外、いまのところ思い浮かびません。
違う方法が思いついたらお答えします。

なず約4年前

手順は
①クローニングしたいDNAを含む生物のゲノムDNAを試料として用意する。
②DNAを制限酵素を用いて断片化する。
③DNAをプラスミドDNAにDNAリガーゼを用いてつなぐ。
④大腸菌に導入する。
⑤大腸菌に寒天培地上でコロニーをつくらせ、必要なコロニーを選ぶ
⑥増殖させた菌から目的のDNA断片を分離する。
です。
これはショットガンクローニング法でしょうか？

安田ヒデ約4年前

ゲノムを繋ぐのでそうだと思います。

tora2ga0 約4年前

これ、マジですか・・・今は高校の範囲でこんなの出るんですか
てっきり形質導入とかそんなレベルかなーと思って開いたら驚きました。
安田さんの回答はいつも勉強になります。横からすみませんw

Joker 約4年前

横から失礼します。
ショットガンクローニング法とは違うのではありませんか？
・クローニングしたいDNAが決まっている
・プラスミドを導入しただけ
ですので、トランフェクションの１つに過ぎないと思いますよ。

なず約4年前

この手順の説明だけじゃ判断しきれないということですか？
理解力がなくてすみません🙇‍♂️

Joker 約4年前

別途コメントをしていますので、そちらをご確認ください。
④の手順がどうなっているのか、がわからないと判断できません。
これは、質問者さんが実際に行った実験ですか？
それとも、授業、教科書や資料集、問題集などで出会った疑問でしょうか？

なず約4年前

定期考査で出題されました。
上記の手順とPCR法を用いるクローニングの手順がばらばらに書かれていてDNA導入を用いるクローニングの手順を選び、またこれを正しく並び変えよという問だったのですが、明確に○○方法と書かれていなかったので気になって質問をしました。

安田ヒデ約4年前

tora2ga0さんコメントありがとうございます。回答がなさそうな質問にはできるだけ答えるようにしています。またいろいろ教えていただければと思います。
Jokerさんのコメントもありがとうございます。
いずれにしろ目的遺伝子がわかっている時はPCRで断片をとってきてあとはせーなさんの書いているような方法でベクターにいれクローニングするのが普通ですが、遺伝子をどのうようにとってくるかはなにからとるか？ですね。
cDNAクローニングが普通でしょうが、ゲノムを制限酵素できってベクターにいれるのは名前で思いつくのはショットガンクローニングしかないですが、高校の授業ではゲノムDNAクローニングでもよさそうでうね。対応するのがcDNAクローニングでしょうがPCRクローニングとのことですので？
まあ名前はともかくゲノムDNAを大腸菌でわけてもそのあと昔ながらのハイブリをすることはしないでしょうから、現在でも行われているのはシークエンスーbbioinformticsによる解析でしょう。
長々とすみません。せーなさんは理論はわかっているようですから、高校では十分と思います。大学、大学院ーーで楽しく研究されればと思います。日本ではまだまだbioinformaticsの人材が不足していますのでもしITに興味がおありでしたらひとうの道だと思います。

tora2ga0 約4年前

まとめると
テストや何かの問題で「これはなんという方法か？」と出題されたわけでなく
「この手順に名前はついていますか？」というのが質問の趣旨で。

その手順はゲノムを対象にしているものの、
ショットガンでのゲノム断片化や配列決定を目的にしているなども不明、
あくまでゲノムを材料にしたクローニングの基礎知識を書いたもので、答えとしては名前はないだろうと。

形質転換の際、効率を上げるために膜透過性を上昇させる必要があって
高校ではリン酸Ca法、ヒートショック法などを教わるが、これはあくまで導入の際の④の手技の名前であると。
一方でゲノムのシーケンスを目的とし、ゲノムをショットガンでバラバラにしてサブクローニングするところまでを一括で呼ぶのがショットガンクローニング法と。

ショットガンクローニング参考
https://www.dna.bio.keio.ac.jp/lecture/bioinfo/bioinformatics-2.pdf

こんな感じですかね？

安田ヒデ約4年前

実際に研究をしている立場からはあまり名前は気にしませんが、高校での理解となると必要かもしれませんね。
高校の先生の立場にたつとおそらくPCRクローニングをを使ったクローニングとゲノムDNAを直接処理してベクターに入れるクローニングの違いを教えたかったのでは。
リガーぜでつないで大腸菌にプラスミドをカルシウム処理してヒートショックなり、電気パルスでいれることはPCRクローニングを含めいずれでも使いますので、まあ、ぜひ回答といえばゲノムDNAクローニングでしょうか。

ゲノムを制限酵素や超音波で切ってクローニングするまではショットガンクローニングでしょう。そのあとは昔なら一生懸命hybridizationをやりましたが、今はまだわかっていない生物のゲノムのシークエンス以外は使わないですね。もしcDNAなどでhybridizationするくらいなら最初からPCRクローニングするでしょうから。ショットガンシークエンスという言葉もあります。
ゲノムでもうわかっているところならPCRクローニングしますのでDNAを制限酵素で切ってクローニングというのはよほどのことがないと使いませんが、やり方は高校での学習では知っておく必要があると思います。