Question

Emily

請問quantitative PCR(定量PCR)和RT-PCR是不是不相同呢？
因為在網上搜尋quantitative PCR(定量PCR)都是出現RT-PCR
另外，是否可以解釋quantitative PCR(定量PCR)呢？
因為目前在網路上看到的資訊都不太能理解

quai        ve
Total RNA was isolated using TBlzol reagent (Invitrogen ! fe
Technologies, Carlsbad, CA, USA) according to the mar facturer's
instructions. The purity and concentration ofthe BRNAw /e

Jme
spectrophotometer (Maestrogen, Las Vegas, NV, USA), and cDNAs
Were synthesized using the miScript II RT kit (Qiagen,
Germany) according to the manufacturer's instructions.
evaluate the expression of MMP-1, quantitative PCR was
performed using the following primers: forward, 5-TCT
GIAGGTTGATCCCAGAGAGCAG-3' and reverse, 5-CAGGG
TGACACCAGTGACTGCAC-3“ using EvaGreen dye (Solis

BioDy                        Line-Gene K software (Bioer
Technology Co,,   Ltd., Hangzhou, China). The Ct value for each
gene was normalized to B-actin using the following primers:
forward, 5“-GGATTCCTATGTGG             3 and reverse, 5/-
GGCTCGGGTGAGGAITCTTCATG-3/          ive expression levels
Of each gene were calculated using the 2-AAct method, as
previously described-

RNA萃取&定量PCR

根據製造商的說明,使用

分離總RNA。使用Ma                   )      Maestrog

對RNA的純度和渡度進行了評價,根據製造商的說明。使用iS
(Qiagen) 合成了cDNAs。為了評估MMP-1的表達。使

用以下引物(子)進行了定量PCR :

正向5-TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG-3'和

向5-CAGGGTGACACCAGTGACTGCAC-3', 使用EvaGreen染料

ss BioDyne) 和Line-GeneK軟件。使用以下引物將每個基因的@

B-actin
向$:-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3',
CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3'。 如前所述,使用2-se'法

 

 

 

 

  

 
   

     

LuyittogenT 生 人 oo

pcr

Answer 1

✨ 最佳解答 ✨

CHW

RT-PCR 對我來說有兩種解釋
一個是 real-time，可以即時定量產物，也稱作 qPCR (quantitative)
另一個是 reverse transcription，將 RNA 反轉錄成 cDNA 再進行放大

圖片裡的看起來像是第二種
但我回答文字中的第一種就好，怕太長

可以做到 "即時" 定量是因為加了特殊的探針，在它的兩側接了 R 和 Q（對不起我不知道這個的中文請容許我用代稱）
機器會偵測 R 發出的信號，可是 R 緊鄰 Q 時信號會被抑制，所以 PCR 開始前沒有信號
在 PCR 進行時，探針會黏合到互補的片段，擋在聚合酶之前，聚合酶會發揮本身外切酶的活性把探針分解掉，R 和 Q 也就分開了
所以隨著 PCR 進行，機器會逐漸偵測到信號，複製出的新股越多信號越強，利用這點就可以從 R 的信號強度來推測出產物濃度

CHW

是說這不是高中生物吧 XD

Emily

謝謝
抱歉！因為不是本科，之前讀的是五專，所以不知道是哪類的～
另外 是否能請你解釋Ct值與2-🔺🔺ct呢

CHW

Ct 是 cycle threshold
達到一定螢光強度所需要的 PCR 循環數
初始濃度越高，Ct 越小

非同時進行的 PCR，Ct 值是沒辦法直接比較的
所以這裡用 β-actin 進行標準化
每個基因的 Ct 值都和 β-actin 的相減
得 ∆Ct

標準化的 ∆Ct 就可以互相比較
不同基因的 ∆Ct 相減就是 ∆∆Ct
實際的濃度差會是指數倍 2^-∆∆Ct
因為 Ct 差 1 = 初始濃度差 2 倍

CHW

話說這裡的定量是用 EvaGreen
是直接測 DNA 的量
比上面的方法簡便，但缺乏專一性

Emily

謝謝仔細又易懂的回答🙇🏻‍♀️

Emily

不知道您方不方便說明“reverse transcription，將 RNA 反轉錄成 cDNA 再進行放大”這個的方法呢？

CHW

其實就只是比一般 PCR 多加了 reverse transcriptase，最後得到的產物是 cDNA