Question

さな

（4）のAでなぜ内部に挿入されたら発現しないのですか？解説お願いします🙇‍♀️

(東京大)
178 大腸菌の遺伝子組換え実験 あるタンパク質G を指定している遺伝子gを,
lacZ 遺伝子を欠いた大腸菌に導入する実験を次のように計画した。 用いた大腸菌は
アンピシリン耐性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を発現しない限り, 抗生物質アン
ピシリンと抗生物質カナマイシンに感受性を示す。
① PCRにより遺伝子を増幅する。 このとき, 増幅された遺伝子の両末端には,
タンパク質 X1 とタンパク質 X2で切断される配列を導入する。 ただし, タンパ
ク質 X1 X2が認識する配列は完全に異なり, 遺伝子の内部にはタンパク質
X1 と X2 が認識する配列はないものとする。
② PCRで増幅された DNA をタンパク質 X1 X2 で切断する。
(3)
ベクタープラスミドをタンパク質 X1 および X2で切断する。 ここで使用するべ
クタープラスミドは,アンピシリン耐性遺伝子とlacZ 遺伝子をもつ。 タンパク
人質 X1 X2はベクタープラスミド上ではlacZ 遺伝子の内部の配列だけを1か所
ずつ切断する。 X1 X2 の切断後は,アンピシリン耐性遺伝子をもつ方の DNA
断片を用いる。

(4)
(5)
②と③で得られた DNA 断片をタンパク質Yによってつなぎ合わせる。
つなぎ合わせたプラスミドを大腸菌に入れ, 抗生物質アンピシリンとX-gal を含
む寒天培地にまき, 37℃で一晩保温する。 コロニーを形成した大腸菌で
lacZ
伝子からタンパク質が産生されると, 無色の X-gal は加水分解され,ガラクトー
スと不溶性の青い物質を生じ,そのコロニーは青色になる。
⑥ できたコロニーが正しく遺伝子の配列を含むかどうかをDNAの塩基配列を
いる方法は,一般的にサンガー法 (ジデオキシ法) と呼ばれる。この方法では
決定することで確認する。 DNAの塩基配列を解析するために広く用いられて
DNAの一方の鎖を鋳型として相補的な DNA を合成する際に,基質として通常
の4種類のヌクレオチド以外に4種類の特殊なヌクレオチドを加える。 この4種
類の特殊なヌクレオチドは, それぞれ異なる蛍光物質で標識されている。 この蛍
光標識は DNA合成に影響を与えない。 通常のヌクレオチドに加えて,この特殊
なヌクレオチドを反応に混ぜ、条件を適切にすることで, ヌクレオチド1個から
すべての長さのDNAを網羅したさまざまな DNA 断片ができ,これを電気泳動
により分離する。 その後, 各断片の蛍光を順次と読み取ることで,もとの塩基配
列を知ることができる。
(1) 遺伝子gの5′
末端付近 3′
末端付近の配列
5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACC......
を右に示す。 途中の配列は,
ACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA-3
......
････として省略している。 遺伝子g を増幅するプラ
イマーの塩基配列として最も適切なものを,次のa~ hからすべて選べ。なお、
タンパク質 X1 X2 で切断するために必要な塩基配列を X1 X2 示す。また,
プライマーの左が5′ 末端,右が3'末端である。 X1とX2 がプライマーの適切
な場所に付加された場合は, PCR反応に影響しないものとする。
a
c
e
g
X1 ATGGTGAGCAAGGGCGAGG b GGACGAGCTGTACAAGTAA X8
X1 TACCACTCGTTCCCGCTCC d CCTGCTCGACATGTTCATT X2]
ATGGTGAGCAAGGGCGAGG [X1
X2 TTACTTGTACAGCTCGTCC
TACCACTCGTTCCCGCTCC X1 h X2 AATGAACATGTCGAGCAGG
(2) タンパク質 X1 および X2はDNA配列のうち、特定の数塩基を認識して切断する。
遺伝子工学の分野でよく使われるこのようなタンパク質を一般的に何と呼ぶか。
(3) タンパク質Yの名称を書け。
(4) 以下の実験 A~D を行った。 タンパク質 X1,X2, Yは完全に DNAに作用
する(DNA の切れ残りやつなぎ残りはない)ものとする。 また、プラスミド
DNAは環状にならないと, 大腸菌の中で安定に維持されないものとする。
[実験A] ①~⑥の実験を計画通りに行った。
[実験B] ②と③でタンパク質 X1を入れないで,①~⑥の実験を行った。
[実験C] ④でタンパク質Y を入れないで, ①~⑥の実験を行った。
[実験D] ⑤で抗生物質アンピシリンの代わりに抗生物質カナマイシンを入れ
て ①~⑥の実験を行った。

Answer 1

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まろん

何の発現についての質問かよくわからなかったのですが、lacZから発現するβガラクトシダーゼのことでしょうか？
lacZの内部に別の遺伝子を挿入すると、lacZの配列は破壊されるので、βガラクトシダーゼは発現できなくなります。

さな

発現できなくなる理由理解できました
一方〜に続く一文がよくわからないのでここも教えてほしいです🙇‍♀️

まろん

この文章だけでは状況がよくわからないので、一方より前の部分の文章も見せてもらえますか？

さな

すいません
お願いします

まろん

追加の画像ありがとうございました。

よくわからないというのは、「一方、タンパク質X1およびタンパク質YはlacZ遺伝子内部の配列であることから」という部分ですかね。

私も考えてみたのですが、確かによくわからないです。
タンパク質X1＝制限酵素
タンパク質Y＝DNAリガーゼ

文章の意味としては、制限酵素とDNAリガーゼがlacZ内部のDNAの配列であるみたいな書き方ですよね。意味不明です。たぶん、この文章は間違っている可能性が高いです。

正しく書くなら、「一方、タンパク質X1およびタンパク質X2が認識する塩基配列は、lacZ遺伝子内部の配列であることから」

こうすれば、制限酵素がlacZの内部を切断して、そこに遺伝子gを挿入するという意味になり、つじつまが合います。

こんな感じでどうでしょうか。

さな

理解できました！ありがとうございます！